转基因牛

2013-06-26 01:30 | 作者: | 标签: 转基因牛



图自actionbioscience.org

牛作为全世界重要的农业动物,为人类的日常生活提供了重要的奶与肉,改善了人们的生活水平,尽管牛的世代间隔长、育种周期长,但由于牛的产奶量高,1头牛产的奶相当于30只羊,因此,开发动物乳腺生物反应器有着广泛的市场前景。世界上多个国家开展了转基因牛的研究,并取得了重要进展,特别是体细胞克隆牛技术的日臻成熟,转基因体细胞克隆牛数量日趋增多,组织特异性表达水平明显提高,每升奶中目标蛋白的表达水平达到了3克以上,呈现出了重要的产业化价值。
 
转基因牛标志性事件:
 
1990年,美国Genzyme Transgene公司利用原核显微注射方法成功获得了世界首例转人乳铁蛋白的转基因牛。
 
1998年,日本Cibelli以母牛输卵管和子宫内膜细胞作为核供体成功制作了世界上第1头体细胞克隆牛。
 
2000年,中国将外源基因注射入体外受精的牛早期胚成功获得了1头转人血清包蛋白基因的转基因牛。
 
2003年,首次通过基因敲除方法成功培育了灭活α-1,3半乳糖苷转移酶基因单等位基因的转基因牛。
 
2005年,美国获得了抗乳房炎转基因牛及培育了富含不饱和脂肪酸转基因猪。 
 
牛的超数排卵、胚胎分割、体外授精、胚胎移植、胚胎冷冻等胚胎工程技术手段已经实现了产业化,在农业人生产中发挥着重要作用。特别是牛的体细胞克隆技术在最近几年取得了重大进展,并已经成为了转基因克隆牛生产的重要技术手段。中国转基因牛研究已经走进了国际前列,获得了国际上最大的转基因牛群体,涉及的性状囊括了动物的抗病性、肉质、奶品之、药用或营养蛋白等。
 
1.1抗病育种
 
疯牛病和羊瘙痒病是一种朊蛋白(Prion protein)类疾病, 2006 年, Yu 等人利用基因打靶的方法获得了PRNP 基因单位点敲除的山羊, 发现其脑部的PrPC 表达量明显下降。2009 年, 中国农业大学也成功培育了PRNP 基因单位点敲除的奶牛。2007 年, Richt 等人利用基因打靶技术制作了PRNP 基因双位点敲除的牛, 发现大脑组织匀浆在体外可抵御朊病毒的传播。这些基因敲除牛在组织病理、临床解剖、免疫、生长繁殖及发育等方面均表现正常。且在体外试验中都能够良好地抵御疯牛病的传播。
 
影响畜牧业健康、可持续发展的另一个重要因素是动物的细菌性疾病。例如,美国每年因奶牛乳房炎而引起的经济损失就高达20 亿美元,且日趋严重。为针对细菌性疾病,抗生素便大量应用于畜牧业生产。随后抗生素应用的负效应不断显现,大量耐药菌株的产生及抗生素的残留引起了人们的广泛关注。因此,一直以来人们积极努力地寻找新型安全有效且无残留的抗生素替代物, 其中细菌素、溶菌酶及抗菌肽等一类具有杀菌活性生物蛋白及多肽成为新进的研究热点, 同时也为动物转基因抗病育种提供了新的思路, 即在转基因动物体内高效表达具杀菌活性的生物蛋白, 可有效地抵抗细菌性疾病。2005年, Donovan 等人发现, 乳腺高表达溶葡萄球菌酶的转基因牛可显著抵抗葡萄球菌的感染(转基因牛的感染率比非转基因牛降低了54%)。
 
1.2 提高牛肉产量和品质
 
动物肉类产品的瘦肉率指标一直倍受人们的关注,该指标也是改良家畜经济性状的一项重要指标。因此,肌肉生长抑制素Myostatin(与肌肉生长相关的调控因子)引起了诸多学者的广泛关注, 约翰霍普金斯大学医学院的McPherron 等人发现, 肌肉特别发达的比利时蓝牛和皮埃蒙特牛的myostatin基因均发生了突变。通过大量的研究发现, Myostatin 是一种分泌蛋白,在发育过程中调控肌纤维的最终数目,是骨骼肌的负调控因子。2010年,内蒙古大学大动物研究中心与内蒙古科维尔公司,利用牛耳上的细胞利用无性繁殖技术成功培育出了敲除Myostatin基因的转基因克隆肉牛,经过与其他牛的对比研究,发现其产肉量高,肉质更为优良。
 
多不饱和脂肪酸是需要从膳食中摄取而不能被人体直接合成的必需营养物质。通过转基因手段将去饱和酶基因整合到家基因组内, 可以一定程度地改变家畜的脂肪组成。2004 年, Saeki等人成功获得了去饱和酶转基因猪, 发现转基因猪的体内白色脂肪组织中不饱和脂肪酸的含量比野生型高了20%, 分离转基因猪的脂肪细胞进行体外分化,发现不饱和脂肪酸的含量比野生型高10倍。2010年,国家转基因肉牛育种课题组开展了第一批以胚胎移植为手段,向肉牛体内转入ω-6脂肪酸脱氢酶基因(FAT1)的工作,以期提高家畜体内的多不饱和脂肪酸含量, 极大程度地改善人们膳食的营养结构,促进人类健康。 
 
1.3 提升牛奶品质
 
改变奶中已有成分的含量或比例是改善奶品质的主要内容之一。2003 年, Brophy 等人将β-酪蛋白及κ-酪蛋白的基因转入牛的基因组中, 使得牛奶中这两种酪蛋白的含量分别提高了 20% 和100%。由于酪蛋白是奶酪中的主要成分,因此这种牛奶更适合做奶酪。
 
乳腺生物反应器是指利用转基因技术在家畜乳腺中特异性表达目的蛋白, 获得具有高附加功能的奶制品。2002 年, Van Berkel 等人将人重组乳铁蛋白转入奶牛体内,发现阳性个体抵抗乳腺疾病的能力显著增强。这也预示着该牛奶潜在的保健功能,可增强免疫力,促进胃肠道健康。利用乳腺生物反应器生产药用蛋白已有很长一段时间,其中,抗凝血酶III已经进入产业化阶段,而其他要用蛋白的制备也已经进入了临床试验阶段,乳腺生物反应器的药用蛋白生产有着广泛的应用前景,可创造巨大的经济效益。2002 -2006年, 中国农业大学李宁院士的团队通过转基因体细胞克隆技术, 成功培育了49头转基因克隆奶牛, 其中存活了29头,使得人乳铁蛋白、人α-乳清白蛋及人溶菌酶在转基因牛的乳汁中平均表达量分别达到3.43 g/L , 1. 55 g/L , 1. 5 g/L,已达到了国际最好水平。
 
1.4 技术研发过程
 
国际上制备转基因牛的主流技术策略是体细胞核移植技术,该技术自1997年诞生以来,经过多年的研究和探索,已经发展为比较成熟和稳定的转基因动物研发技术体系。该技术相较于其他转基因技术有如下两个方面优势:第一,从理论上来讲,阳性细胞进行核移植后能够得到100%的转基因动物, 可大大减少代孕母畜的数量,非常适合于转基因大家畜的制备;第二,该技术在转基因生物安全方面具有其他方法无法取代的技术优势,可以在转基因阳性细胞水平上对外源基因整合位点、细胞基因表达影响以及对细胞周期、细胞增殖、凋亡等安全性指标进行研究评估后,有选择性的进行体细胞核移植制备转基因牛,不但可以提高转基因安全性,还可以提高效率、降低研发成本。
 
随着体细胞核移植技术体系的逐步稳定和成熟,转基因牛技术目前主要发展方向是高生物安全性,将生物安全性策略贯穿于整个技术过程。从方案设计、外源基因选择、启动子选择再到重组载体构建、外源基因整合策略及转基因阳性细胞的鉴定等技术过程,始终以生物安全性为第一要素,贯彻始终。
 
1.4.1 目的基因的选择。在外源基因选择方面,首要因素是对人类无害的基因,如果人类基因组中存在同源基因,那么首先选择人类的同源基因,这主要是考虑转基因动物食品不会带来人类的免疫性问题,同时由于哺乳类动物基因之间的高同源性,人类大多数基因与牛的同源基因相差几个氨基酸,导入牛细胞后不会对牛产生影响,如抗病转基因牛中使用的人溶菌酶和人防御素基因。如果目的基因来自其他物种或者使用干扰RNA,那么就需要严格的实验验证,确认其对人类及牛细胞无害后,方可采用,如在抗口蹄疫转基因牛中采用的干扰RNA,就是经过大量实验筛选的结果。
 
1.4.2 启动子的选择。启动子是在转基因动物基因组中驱动外源基因表达的关键元件。启动子选择主要遵循两个原则,第一选择动物自身的启动子序列,降低对动物基因组的安全性风险,如抗结核转基因牛研制过程中选择的免疫细胞特异性启动子;第二选择组织特异性启动子,使得外源基因在动物体内特定的组织表达,不但可以降低转基因动物食品的生物安全性风险,同时也可最大程度的减少对转基因动物生理形状的影响。如抗乳房炎转基因牛选择乳腺特异启动子,在牛的乳腺组织中特异表达人溶菌酶(存在于人乳中的一种抗菌蛋白)。
 
1.4.3 重组表达载体的构建。载体构建的第一要素是不使用病毒性载体骨架,虽然逆转录病毒骨架载体会使得基因整合效率提高,但是其会带来安全性隐患。第二,载体上除目的基因外,其他序列如抗性筛选基因neo和阳性细胞筛选基因GFP等序列两侧都要构建Cre-Lox位点,目的是将来可以特异性从基因组切除,消除这些基因在动物体内表达所带来的安全性风险。
 
1.4.4 目的基因向体细胞的高效转移。随着生物安全性要求的提高,外源基因整合动物基因组的方法也在向着定点整合降低影响的方向发展。目前已经摒弃了逆转录病毒和随机整合等方法,因为这些手段都会或多或少的带来生物安全性隐患。主要采用位点特异性重组酶介导的定点整合技术和基因打靶技术。其中最安全的是基因打靶技术,该技术应用同源重组原理,在动物基因组的特异位点插入外源基因,是最安全的也是对动物基因组影响最小的一种方法。其次是位点特异性重组酶介导的定点整合技术,重组酶会将外源基因定点整合到牛基因组的几个位点上,而不会影响其它基因的表达。
 
1.4.5 转基因阳性细胞的鉴定。这是体细胞核移植技术在转基因动物生物安全性生产应用的最大优势。在转基因阳性细胞获得后,以下工作主要围绕生物安全性指标进行。如确定外源基因插入的序列正确性,整合位点,整合拷贝数;诱导外源蛋白表达,检测表达蛋白的氨基酸序列正确性,外源基因的活性,外源基因表达对整合位点附近基因表达的影响及对整个细胞基因表达的影响;检测细胞周期,细胞增殖,细胞凋亡等指标,只有全部通过评估的细胞才会用来进行体细胞核移植进行转基因动物生产。
 
一直以来,转基因动物的安全性是人们广泛关注的问题。2007年,Yang等人首次对克隆动物与非克隆动物肉及奶的组分进行了对比分析,发现二者的生理生化指标并无区别。此外,Laible等人对克隆奶牛及转基因奶牛奶样、奶酪的化学成分进行了分析,结果显示,克隆牛乳汁中的脂肪酸、矿物质、氨基酸、维生素等指标的含量与普通牛基本一致;转酪蛋白基因的转基因奶牛初乳中IgG的水平与正常奶牛相似。 Appel 等人用转基因牛生产的人重组乳铁蛋白进行小鼠饲喂试验, 在连续饲喂13 周后,发现饲喂人重组乳铁蛋白的小鼠在临床表现、行为学观察、不同组织器官检测、生理生化指标检测上均为出现异常。这些研究结果说明,利用转基因动物、克隆动物生产药物、食物并不会对人体带来危害。2009年,美国食品药品管理局(FDA)首次批准了转基因山羊奶中分离的抗血栓药物重组人抗凝血酶(Atryn)的上市。这将标志着利用转基因动物生产药物真正迈入产业化时代。而动物中存在的生殖隔离现象,使得人们普遍担忧的“基因漂变”问题在转基因动物中发生的几率几乎为零。Wheeler 等人对转入了牛α-乳清蛋白的转基因猪进行了环境风险评估, 将与转基因公猪交配2、7天的非转基因母猪和与转基因猪同圈饲养的非转基因猪的不同组织器官进行PCR 检测, 在非转基因猪的基因组内并没发现外源基因的存在。
 
目前,转基因动物及其制品的产业化应用还处于起步阶段。国际上,2006 年欧洲医药评价署人用医药产品委员会首次批准了用转基因山羊生产的抗血栓药物Atryn的上市。 随后,2009 年美国食品和药物管理局也批准了转基因生产的Atryn 在美国上市,乳腺生物反应器的要用蛋白生产正式进入产业化阶段。中国农业大学李宁院士研制的人乳铁蛋白、乳清蛋白、溶菌酶转基因克隆牛已进入生产性试验阶段。
 
2006年, 美国GTC公司利用转基因山羊生产的重组人凝血酶III药物在欧洲批准上市, 成为世界首例成功上市的以转基因手段生产的药物,开启了转基因动物制药的新纪元。荷兰的GenPharm 公司利用转基因牛生产乳铁蛋白,经初步统计每年乳铁蛋白的营养奶粉销售额可达50亿美元。
 
资料来源:
 
农业部农业转基因生物安全管理办公室等,《转基因30年实践》,中国农业科学技术出版社,2012
 

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